基于大数据库寻找皮肤细胞淋巴瘤潜在治疗药物

皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphmas，CTCL）是一组具有异质性的罕见疾病，以T淋巴细胞聚集为主或T淋巴细胞完全克隆性聚集于皮肤为特征，主要常见亚型为Sezary综合征和蕈样肉芽肿。CTCL治疗主要分为系统治疗和局部治疗，由于系统治疗不良反应较大，因此临床使用受到较大限制；而局部用药治疗对于早期患者效果明显，但后期治疗效果并不理想［1-2］。因此，寻找CTCL新疗法具有重要的意义。Connectivity Map（CMap）是一个工具型在线生物信息学数据库，包含7 000多个恶性肿瘤细胞系基因表达谱和1 309个药物分子。CMap通过高辨别率和特定的模式匹配算法，将药物从正相关到负相关进行排序，可以用来筛选对基因或疾病起作用的药物化合物。CMap目前已被成功运用于弥漫性大B细胞淋巴瘤［3］、结直肠腺癌［4-5］、食管癌［6］、颈部鳞状细胞癌［7］、乳腺癌［8］和成神经管细胞瘤［9］等恶性肿瘤疾病的新治疗药物的挖掘和旧药新用的研究中。

已知罗米地辛对CTCL细胞有杀伤作用。本课题组推测如果一个药物作用通路与罗米地辛作用于CTCL相关通路相同，这一药物也可能具有治疗CTCL的潜力。本研究从GEO数据库下载经罗米地辛处理前、后的CTCL细胞表达谱芯片数据，重新整合分析差异基因；通过DAVID数据库进行GO分析和KEGG信号通路富集得到罗地米辛作用于CTCL的关键信号通路；将差异基因导入CMap数据库，获取可作用于差异基因的药物分子；通过SubpathwayM iner对CMap数据库中药物分子作用信号通路进行识别提取，结合识别罗地米辛作用CTCL的关键通路与CMap数据库涉及通路取交集得出重叠的通路；最后对之前通过CMap数据库确定作用于差异基因的药物进行进一步筛选，选择可以作用于重叠通路的小分子化合物,即为可用于治疗CTCL的候选药物。

1 材料和方法

1.1 差异基因筛选 从GEO数据库获取基因表达谱芯片（GSE）数据。该基因表达谱数据包含3个CTCL细胞株（SeAX,HH和Hut78）和6例Sezary综合征的病人CD4+T细胞用DMSO对照和药物处理的基于Illum ina Hiseq 2500的研究数据，由美国哥伦比亚大学上传。剔除使用氮芥以及联合治疗方案处理后的表达谱数据，留下使用罗米地辛处理后及空白对照处理组的数据，应用limma R软件包对表达谱数据进行分析，并通过软件包对数据进行组间和组内的标准化。差异基因的阈值为P＜0.05，|log-FC|＞1.5［10］。

1.2 差异基因的功能分析 利用DAVID（

1.3 综合分析CMap数据库和KEGG通路 将表达上调和下调的差异基因分别上传到CMap数据库进行在线分析，下载详细结果，首批筛选药物为可作用于差异基因的药物分子。为了解药物在CTCL中的潜在作用机制，对KEGG和CMap数据库（ iner确定CMap数据库中每个药物分子对应作用的104个亚通路，分别属于33个完整通路［11］。将CMap数据库药物影响的通路和CTCL相关KEGG通路取交集，作用于重叠通路的药物分子被认为是CTCL的潜在药物（FDR＜0.1）。利用STRING数据库描绘重叠通路中差异基因的PPI网络图，通过计算节点的连接度来筛选核心基因。为进一步展示药物与靶向基因的关系，利用Cytoscape［12］软件进一步绘制出药物－靶向基因网络图。

1.4 CTCL候选药物的验证 为了对筛选出来的药物进行进一步的筛选及验证，本研究通过Sybyl X-2.1.1（Tripos Inc.）［13］对核心基因和药物进行分子对接，验证核心基因与候选药物之间的靶向调控关系。从PubChem获得候选药物分子的结构公式，从蛋白数据库（protein data bank，PDB）获得核心基因的蛋白结构；输入蛋白质和药物分子结构式后，Sybyl将自动计算对接分数。对接分数是评价核心基因蛋白与候选药物结合亲和力的基础，6分以上代表两个分子之间有很强的亲和力。

2 结果

2.1 通过GEO数据库筛选出差异基因 通过处理GSE芯片的表达谱数据，筛选出CTCL经罗米地辛处理前、后的630个差异基因，见图1。

红色为上调的差异基因；绿色为下调的差异基因。图1 差异基因的火山图

2.2 差异基因的功能分析 GO富集的结果显示，差异基因显著富集到112个GO项目，包括20个分子功能（molecular function）项目，64个生物过程（biological process）项目和28个细胞组成（cellular component）项目（均P＜0.05），排名前10的GO项目，见表1。通过KEGG通路富集差异基因显著富集到12个通路（P＜0.05），其中Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）（hsa04390）、基底细胞癌（basal cell carcinoma）（hsa05217）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）（hsa04310）、黑 色 素 生 成（melanogenesis）（hsa04916）和突触囊泡循环（synaptic vesicle cycle）（hsa04721）是排名前5的KEGG通路，见图2。

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